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技術(shù)文章

NK-92細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項

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NK-92細(xì)胞特性

NK-92細(xì)胞生長特性為懸浮生長,收到細(xì)胞后先觀察瓶身是否完整,無漏液現(xiàn)象,培養(yǎng)基是否澄清透亮,在顯微鏡下觀察細(xì)胞;

75%的酒精擦拭瓶身后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶先豎立靜置2~4個小時,讓細(xì)胞沉降到底部;細(xì)胞靜置完后,將瓶中上面部分培養(yǎng)基小心吸出,留底部細(xì)胞和3ml左右培養(yǎng)基在原瓶;

吸出的細(xì)胞培養(yǎng)基離心收集細(xì)胞沉淀,離心轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)3分鐘,或根據(jù)您的離心機實際情況而定,NK-92細(xì)胞對離心敏感,轉(zhuǎn)速不宜過高;用2~3mlNK-92完培將得到的細(xì)胞沉淀重懸后,放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)過夜,一個T25培養(yǎng)體積是5~6毫升;

NK-92細(xì)胞可按照200U/ml的濃度補加IL-2。

培養(yǎng)瓶為不透氣瓶蓋,一定要擰松到不掉的程度,使細(xì)胞充分透氣;培養(yǎng)瓶橫放,瓶口擰松透氣,培養(yǎng)過夜;

顯微鏡下觀察細(xì)胞,視細(xì)胞密度和培養(yǎng)基消耗情況,進(jìn)行傳代。不建議直接進(jìn)行離心操作,因為經(jīng)過運輸顛簸和各種處理,細(xì)胞很可能達(dá)不到最佳狀態(tài)。盡量不要吹散細(xì)胞團,加完液輕晃培養(yǎng)瓶即可。

 

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

NK-92細(xì)胞為懸浮生長,大部分細(xì)胞聚集成團,少數(shù)細(xì)胞分散,并且細(xì)胞間隙會有較多的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片,且培養(yǎng)過程中經(jīng)常能觀察黑色的顆粒和小黑點,這些黑點大概是細(xì)胞帶的,一般少量黑點不增殖不會影響細(xì)胞的生長,若黑點繁殖生長則懷疑細(xì)胞污染,會影響細(xì)胞生長,甚至使細(xì)胞死亡。

NK-92細(xì)胞對IL-2敏感。培養(yǎng)基中IL-2降解,將導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差。IL-2長期保存溫度為-20℃,解凍后置于4℃冰箱保存,4℃保存不應(yīng)超過兩周。配制好的新鮮培養(yǎng)基要盡快用完,使用前預(yù)熱,使用完畢后放回4℃冰箱保存;

NK-92細(xì)胞對離心敏感。正常培養(yǎng)時,換液周期為2~3天,建議交替使用半量換液和離心換液法,即半量換液2~3次后,離心全量換液一次。盡量減少離心次數(shù),細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞量少的時候,一般不建議離心。

 

細(xì)胞團塊是否需要吹散?

團塊需要吹散,但不用刻意吹散成單顆;

正常傳代或者離心換液后吹打,控制吹打次數(shù)以及力度,即使細(xì)胞都分散成單個,也會在1~2天內(nèi)聚集起來;細(xì)胞團太大時,需要分散;

細(xì)胞凍存的時候,細(xì)胞需要盡量分散,否則影響凍存效果。


換液方法
(1) 
補液法:2~3天補加適量(根據(jù)培養(yǎng)容器和原來細(xì)胞懸液體積來定,T25瓶一次補液1~2毫升即可)新鮮培養(yǎng)基,同時補加200U/mlIL-2,補加2-3次之后,離心全部換液。

(2) 半換液法:T25瓶子(瓶中裝有5ml培養(yǎng)基)為例,豎起瓶子靜置一段時間(豎瓶前輕拍培瓶,讓輕貼底部的細(xì)胞團浮起來),待細(xì)胞沉底(肉眼觀察細(xì)胞沉底情況),小心吸出2.5ml上清轉(zhuǎn)移到離心管,1000rpm 3~5min離心,離心后的細(xì)沉淀用2.5ml新鮮培養(yǎng)重懸后放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長時,聚集的細(xì)胞團會逐漸增大,正常的細(xì)胞團在顯微鏡下呈現(xiàn)白色透亮狀。若細(xì)胞聚集太多,出現(xiàn)細(xì)胞團中部發(fā)暗時,可進(jìn)行傳代。

 

傳代方法

將細(xì)胞團用移液器輕輕吹散(一般吹2-3次即可,吹打力度不可過大,否則會出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片),均分到兩個瓶子里,每瓶再補充等量培養(yǎng)基。細(xì)胞對營養(yǎng)要求很高,細(xì)胞量過多時會影響細(xì)胞生長;細(xì)胞團塊過大時,需要稍微吹散,注意控制吹打次數(shù),不需要全部吹散。

 

細(xì)胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比,NK-92細(xì)胞可適量補加IL-2;盡量吹散細(xì)胞,注意控制吹打力度。

 

細(xì)胞復(fù)蘇

復(fù)蘇后,用6ml新鮮培養(yǎng)基,重懸細(xì)胞;離心后去除上清用1~2mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,注意要少次輕柔吹打。
瓶子豎著放進(jìn)培養(yǎng)箱,以增加細(xì)胞局部密度,瓶蓋保持透氣;
細(xì)胞生長需要穩(wěn)定的環(huán)境,可每天觀察1次,不要頻繁拿出培養(yǎng)箱觀察


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